對(duì)于奮戰(zhàn)在防非一線(xiàn)的人來(lái)說(shuō)，Ct值不是個(gè)陌生的名詞，但據(jù)筆者的了解，似乎并不是所有人完全理解Ct值的含義。本文嘗試簡(jiǎn)單梳理一下關(guān)于Ct值的一些背景知識(shí)。

什么是PCR？

想要知道Ct值，先要了解PCR。PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，DNA聚合酶介導(dǎo)的合成DNA鏈的反應(yīng)。是對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增（大量的翻倍復(fù)制）的方法。

為什么需要對(duì)DNA片斷進(jìn)行擴(kuò)增？因?yàn)橥ǔＧ闆r下病毒DNA的含量太低了，即使是經(jīng)過(guò)了提純，仍然沒(méi)辦法直接測(cè)量有無(wú)和多少，所以需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增。以目標(biāo)DNA為模板，對(duì)這段DNA進(jìn)行復(fù)制粘貼，使這段DNA能夠檢測(cè)到，甚至達(dá)到可以用肉眼看的到的量。

擴(kuò)增一次需要一個(gè)特定流程，即通過(guò)高溫使一個(gè)雙鏈DNA拆成兩個(gè)單鏈，然后降溫到聚合酶的活性溫度，聚合酶以?xún)蓚€(gè)單鏈DNA作為模板，又生成兩個(gè)新的雙鏈DNA，即實(shí)現(xiàn)了對(duì)原來(lái)DNA片段的“克隆”。所以我們使用的PCR儀，本質(zhì)是一個(gè)溫控設(shè)備，而其中用到的聚合酶當(dāng)然也必須是可以耐高溫的聚合酶。

如何確定要復(fù)制哪一段DNA呢？這時(shí)候就需要使用引物（與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的一個(gè)短片段）來(lái)開(kāi)個(gè)頭，從而引導(dǎo)后續(xù)的合成，這樣就確保只對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。

通過(guò)一次這樣的程序，1個(gè)目標(biāo)DNA片段變成了2個(gè)。而之后的流程則是重復(fù)這個(gè)程序，所以一個(gè)這樣的程序稱(chēng)為一個(gè)循環(huán)（Circle）。原理上，如果只有1個(gè)目標(biāo)DNA片段，經(jīng)過(guò)1次循環(huán)獲得2個(gè)同樣的DNA片段，如果經(jīng)過(guò)5次循環(huán)得到2^5個(gè)同樣的DNA片段即32個(gè)，如果40個(gè)循環(huán)得到2^40次方個(gè)這個(gè)DNA片段，即1,099,511,627,776個(gè)。當(dāng)然如果送檢樣本里沒(méi)有目標(biāo)DNA，0^40次方仍然是個(gè)0。

注意這里有個(gè)前提，就是必須有足夠量的合成原料，即引物和游離核苷酸。所以PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA片段與細(xì)菌增值曲線(xiàn)類(lèi)似，前期指數(shù)增長(zhǎng)，后期如果原料耗盡則曲線(xiàn)拉平。

Ct值的含義

在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)之上，通過(guò)一定的技術(shù)設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)合成的DNA的數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，也就是實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，qPCR。

而測(cè)量的方法則一般是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，比如我們可以在反應(yīng)體系中加入某種熒光染料（方法之一），這種染料特異性的摻入DNA鏈之后就會(huì)發(fā)出熒光。結(jié)果制造出的目標(biāo)DNA片段數(shù)量越多，則發(fā)出的熒光越強(qiáng)。

給熒光強(qiáng)度設(shè)定一個(gè)檢測(cè)閾值，即所需測(cè)量的熒光的強(qiáng)度超出背景熒光強(qiáng)度的臨界點(diǎn)（也就是Ct中的t，threshold），當(dāng)需要測(cè)量的熒光強(qiáng)度超過(guò)這個(gè)閾值時(shí)，這個(gè)時(shí)候跑了多少個(gè)循環(huán)（Ct中的C，即代表Circle），如果跑了25個(gè)循環(huán)，那么Ct值就是25。

當(dāng)原始樣本中目標(biāo)DNA的越多，達(dá)到這個(gè)臨界值所需要的循環(huán)次數(shù)越小，所以Ct值越小意味著，原始樣本中這種DNA的濃度就越高，對(duì)于非瘟檢測(cè)來(lái)說(shuō)，就是非瘟感染越嚴(yán)重。

通常實(shí)時(shí)定量PCR跑40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，如果Ct值小于29被認(rèn)為是強(qiáng)陽(yáng)性，如果Ct值在30-37之間認(rèn)為是陽(yáng)性，Ct值在38-40之間，則可能是含有最小量的目標(biāo)DNA，也可能是環(huán)境污染導(dǎo)致。

主要參考來(lái)源：

https://www.wvdl.wisc.edu/wp-content/uploads/2013/01/WVDL.Info_.PCR_Ct_Values1.pdf

https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction

https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/real-time-pcr-understanding-ct.html