摘要：為了更好的理解如何提高商品疫苗產生更好的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的免疫效果，本研究在田間條件下進行了不同免疫方案的對比，包括一次滅活疫苗（INV），一次活疫苗，以及活疫苗和滅活疫苗的組合使用。試驗1（E1），21頭豬分為三組，A組動物在2.5，3.5和6.5月齡免疫商品滅活疫苗；B組動物在1.5，2.5，5.5和6.5月齡免疫滅活疫苗，C組為對照組，不免疫。所有豬在7.5月齡時攻毒，觀察21天。試驗2（E2），32頭豬均分為4組，A組，B組，C組均在1.5月齡免疫商品活疫苗，D組為對照組。A組和C組于4.5月齡免疫滅活疫苗，B組第二次免疫活疫苗。C組于第二次免疫后一個月再免疫一次滅活疫苗。所有豬在6.5月齡進行攻毒。兩個試驗中，對比不同免疫方式的總抗體，中和抗體（NA）和細胞免疫（CMI），以及攻毒后的病毒血癥的差異。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征，免疫，細胞免疫，中和抗體

試驗1中，免疫兩次和多次滅活疫苗后均可誘導高水平的的Y干擾素（IFN-Y）反應。免疫滅活疫苗的豬與未免疫的對照豬相比，攻毒后可以更快產生中和抗體。試驗2中，再次免疫滅活疫苗的豬和再次免疫活疫苗的豬產生的中和抗體情況相似。但是，只有C組動物中和抗體滴度在攻毒后明顯升高。在誘導細胞免疫反應方面，活+死這樣的組合免疫方案要優(yōu)于單獨使用活疫苗?？傊?，一次免疫的話，活疫苗可以誘導最好的免疫反應。之后，再次免疫滅活疫苗是最好的免疫方案，可以誘導更好的免疫反應。

背景介紹

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）在北美首次發(fā)現。至今已超過20年?，F在PRRSV仍然是豬的主要傳染病病原之一。PRRSV屬于動脈炎病毒屬，有2個基因型：基因Ⅰ型（歐洲型）和基因Ⅱ型（美洲型）。PRRSV感染母豬，可以引起流產，死胎和木乃伊胎，以及其他繁殖障礙。感染斷奶仔豬和生長豬群，會引起豬呼吸道綜合征。

PRRSV在豬場中持續(xù)存在，導致PRRS成為地方性疾病。尤其在非免疫母豬比例增加時，或者在新的強毒株進入豬場時，PRRS會頻繁發(fā)生。維持母豬有足夠的免疫水平是減少感染所必需的。商品化的PRRS疫苗可以誘導免疫，減少繁殖障礙，至少對基因Ⅰ型是有效的。盡管如此，由于PRRSV的基因多樣性和同一個基因型的毒株眾多，現有商品疫苗的保護力往往是有限的。因此需要新的免疫策略在一定程度上克服PRRSV基因多樣性的特點，為豬群提供可靠的免疫水平。

PRRS商品活疫苗和滅活疫苗均為基因Ⅰ型的。滅活疫苗安全性高但是免疫原性較低，而活疫苗有較高的免疫原性，但能否用于懷孕母豬仍存在疑慮。疫苗免疫的安排也主要依據后備豬是如何馴化的，尤其是被選中的后備母豬在進入隔離/馴化設施前后均有可能接觸到PRRSV。

普遍認為一頭份的滅活疫苗不能誘導明顯的免疫反應，但是重復接種滅活疫苗可以誘導高水平的細胞免疫（CMI）。已經感染PRRSV或者免疫過PRRS活疫苗的豬在免疫滅活疫苗后產生的免疫反應也很高。在此基礎上，可以參考其他動物疫苗的免疫方案，用PRRS活苗+死苗的免疫組合策略來抵抗PRRSV的感染。

本研究對比了不同的PRRS疫苗免疫方案，包括滅活疫苗，活疫苗和活苗死苗組合使用。目的是探究商品疫苗如何盡可能做到安全有效的馴化后備母豬和免疫經產母豬，以及多次疫苗接種對PRRSV特異性免疫的影響。

材料和方法

所有試驗通過了巴塞羅那大學動物和人類試驗福利委員會的批準（批準文號：665）.

試驗1設計

試驗1和試驗2的整體設計見表1。試驗1中，21頭4周齡健康仔豬（長白×大白）隨機從豬場挑選。該豬場為PRRSV和豬瘟，非洲豬瘟，豬偽狂犬病陰性場。之后將動物轉移至試驗豬場，標記耳牌，隨機分為三組，每組7頭。A組動物在2.5，3.5，6.5月齡分別肌肉注射商品滅活疫苗，2 ml/頭（Progressis，Merial：P120株，在試驗室條件下接種2次后，免疫熒光檢測抗體滴度 ≥ 2.5log10）佐劑類型為水包油。B組動物在1.5，2.5，5.5和6.5月齡分別免疫同樣的滅活疫苗。C組動物在其他組動物免疫時接種疫苗佐劑作為安慰劑。

最后一次免疫后3周，將試驗豬轉移至動物衛(wèi)生中心（CReS A）飼養(yǎng)7天適應新的環(huán)境。7.5月齡時所有豬攻毒，每頭豬鼻內接種2ml，病毒量為1×106 TCID50的PRRSV 2749株病毒液。該毒株與Lelystad病毒株ORF5的同源性達到99%. 攻毒后觀察21天，每天監(jiān)測臨床癥狀及發(fā)熱情況。

試驗2設計

斷奶時隨機挑選32頭豬（來源同試驗1）轉移至試驗豬場（同試驗1）（見表1）。6周齡時隨機分為4組，每組8頭。A，B，C組均免疫PRRS商品活疫苗（Porcilis PRRS，MSD AH: DV 株，≥104 TCID50/頭份），D組接種無菌生理鹽水。4.5月齡時，A組和C組接種1頭份滅活疫苗（疫苗同試驗1）。B組則再接種1頭份活疫苗。一個月后（5.5月齡）C組動物第三次接種滅活疫苗，其他豬接種生理鹽水。滅活疫苗與活疫苗毒株的ORF5的同源性大于95%，ORF7同源性為100%. 6.5月齡時所有動物攻毒，觀察21天。

試驗開始前，兩個試驗的豬均確定為PRRSV抗體陰性，豬肺炎支原體，豬流感病毒陰性。開始前PCV2抗體陽性，但之后為轉血清陰性，說明該抗體為母源抗體。

免疫期間和攻毒后0，3，7，14，21天采血。每個血樣采兩份（類肝素酶處理采血管和硅化處理采血管）。血清用于檢測病毒血癥，PRRSV特異性抗體和中和抗體。類肝素酶處理的抗凝血用于獲得外周血單核細胞（PBMC），用ELISPOT檢測IFN-γ，用ELISA檢測IL-10.

體液免疫

用ELISA檢測PRRSV特異性抗體。攻毒期間使用PRRSV分離毒株（如2749分離株）檢測中和抗體變化。簡單來說就是將50 μL血清樣品用細胞培養(yǎng)基進行2倍到128倍連續(xù)稀釋。稀釋后與50 μL，200 TCID50的PRRSV 2749株病毒懸液混合。病毒血清混合液37℃孵育1小時，加入MARC-145細胞的96孔板中，一份樣品三個孔，37℃，5% CO2孵育3天。用IPMA監(jiān)測細胞感染情況。另外，試驗1 的豬在攻毒后14和21天，試驗2的豬在4.5月齡，5.5月齡和攻毒后14天檢測中和抗體。

細胞免疫評估

兩個試驗的豬免疫期間每個月監(jiān)測一次細胞免疫，攻毒后7，14，21天監(jiān)測細胞免疫的變化。包括ELISPOT檢測細胞介導的PRRSV特異性免疫反應，商品化單克隆抗體檢測IFN-γ分泌細胞（IFN-γ-SC）的數量。簡而言之，先將5×105, 2.5×105和1×105的PBMC用PRRSV分離株2749株處理，病毒量按照感染復數（MOI）為0.01計算。沒有被處理的細胞和PHA處理的細胞（10 μL/mL）分別作為陰性和陽性對照。PRRSV特異性IFN-γ-SC數量由病毒處理的數量減去未被處理的空斑點的數量計算而得。IFN-γ-SC頻率按照106 PBMC反應細胞的數量來表達。

為了評估滅活疫苗免疫是否能夠誘導白介素10（IL-10）產生，對試驗1中樣品的PBMC進行了IL-10的檢測。簡而言之，將5×105細胞用PRRSV分離株2749株處理20個小時，MOI為0.01. 之后按照先前報道的方法，使用商品化單克隆抗體檢測細胞懸液中IL-10的表達情況。細胞因子濃度（pg/mL）按照廠家給出的標準進行計算。病毒特異性IL-10濃度由病毒處理孔的值減去對照孔濃度得到。

病毒血癥檢測

兩個試驗中，動物在攻毒當天和攻毒后3，7，14，21天采血。提取的血清使用巢式RT-PCR檢測PRRSV的情況。試驗1中，攻毒當天和攻毒后 3，7天采集鼻拭子也進行PRRSV抗原的檢測。

統(tǒng)計分析方法

數據使用StatDirect v2.7.7進行統(tǒng)計分析。使用Kruskal-Wallis檢驗和Conover-Inman方法對各組平均數進行比較。陽性率使用X2檢驗進行比較。

結果

臨床癥狀和體溫

兩個試驗中，疫苗免疫組和對照組的動物均未出現或者表現非常微弱的呼吸道癥狀。沒有豬表現發(fā)熱情況。

體液免疫

表2a和b總結了ELISA檢測情況。試驗1中，9/14（64%）的豬在攻毒前血清轉陽。攻毒后，A組和B組所有豬在試驗結束時血清轉陽。攻毒前轉陽的豬，S/P值在攻毒后沒有明顯升高。試驗2中，所有接種疫苗的豬（A，B，C組）均在2.5月齡時抗體轉陽（活苗免疫后1個月）。S/P值在再次免疫或者攻毒后依然沒有明顯的升高。兩個試驗中，對照組的豬在免疫期間保持ELISA和中和抗體陰性。

表3a和b總結了中和抗體的結果。試驗1中，攻毒前， A組1/7 （14.3%），B組3/7 （42.9%）和抗體為陽性，但是滴度很低（1-3 log2）。攻毒后，A組和B組動物產生了記憶性免疫應答。攻毒后14天，兩個免疫組與對照組相比，表現出較高的免疫應答，抗體陽性率較高（A = 7/7；B = 7/7；C = 2/7；P = 0.02）。攻毒后21天的平均值也同樣高于對照組（A = 4.0 ± 0.6；B = 4.6 ± 0.8；C = 3.0 ± 0.6；A vs C：P = 0.07；B vs C：P = 0.003）。

試驗2中，接種一次活疫苗的動物中和抗體陽性率很低，中和抗體滴度也很低（log2=1）。第二次接種活疫苗的B組在5.5月齡時有4/8（50%）的豬中和抗體轉陽，接種滅活苗的A組和C組則有7/16（43.8%）的豬轉陽。攻毒時，疫苗免疫組之間，中和抗體陽性率以及抗體平均滴度沒有統(tǒng)計學差異。攻毒后14天，所有免疫活苗+死苗的動物檢測到中和抗體（A組和C組均為8/8）。而僅免疫活疫苗和對照組中的一些動物仍然沒有檢測到中和抗體（B組7/8，D組4/8；A = C ＞ D，P = 0.03）。另外，C組中和抗體滴度平均值最高（C =3 .6±1.2；A = 3.2 ± 0.7；B = 2.1 ± 1.3；D = 2.2 ± 0.5；C ＞ B和D；P = 0.02和0.04），攻毒后也升高的最快（P = 0.04）。

PRRSV特異性IFN-γ-SC的分析

圖1a和b描述了試驗1和試驗2中PRRSV特異性IFN-γ-SC的變化情況。試驗1中，PRRSV特異性IFN-γ-SC在免疫兩次滅活疫苗后開始產生（5.5月齡；平均數±標準差：A = 33± 5；B = 98 ± 5；C = 2 ± 0 , IFN-γ-SC；B ＞ A，P = 0.005; B ＞ C，P ＜ 0.0001；A ＞ C，P = 0.001）。兩個免疫組在6.5月齡攻毒前的IFN-γ-SC平均值達到最大（A = 83±23，B = 124 ± 34；A = B； A ＞ C， P = 0.0014； B ＞ C， P＜ 0.0001）。攻毒導致兩個疫苗組的PRRSV特異性IFN-γ-SC數量上升：A組從攻毒當天的49 ± 10上升到攻毒后7天的107 ± 19（P = 0.07）；B組則從26 ± 8到59 ± 10（P = 0.004）。之后（攻毒后14到21天）兩組沒有差異。兩個試驗中免疫滅活疫苗的豬均有高水平的IFN-γ自發(fā)產生（在計算結果里已經減去）。

試驗2中，免疫組和對照組在5.5月齡第一次出現顯著差異。首免活苗二免滅活苗的豬最高（A = 155 ± 16；B = 75 ± 5；C = 139 ± 19；D = 9 ± 2；A = C ＞ B ＞ D；P ＜ 0.0001）。攻毒當天，三個免疫組的值均高于對照組（P ＜ 0.05），且C組（一次活苗+兩次滅活苗）的PRRSV特異性IFN-γ-SC值最高（C ＞ D，P = 0.0002；B ＞ D，P = 0.01；A ＞ D，P = 0.04）。攻毒導致兩個二免滅活苗組IFN-γ-SC的值顯著升高：A組從攻毒當天的50 ± 25上升到攻毒后7天的103 ± 18；C組則從72 ± 16到173 ± 15（P ＜ 0.05）。攻毒后2周，僅A組和C組出現了比未免疫組和攻毒對照組更高的值。之后所有組的IFN-γ-SC平均值開始下降，但是A組仍然明顯高于其他組。（P ＜ 0.02）。

檢測試驗1的 PBMC中病毒特異性IL-10時發(fā)現，在攻毒當天僅A組中有2頭豬為陽性，陽性豬的平均值為22.7±9 pg/mL。攻毒后7天每組都只有1頭豬為陽性。攻毒后14天，A組有5頭，B組有6頭，C組有4頭為陽性，陽性豬的平均值：A=74.7±36.3；B=110.9±52；C=138.5±75.4 pg/mL。

病毒血癥檢測

試驗1中，攻毒后7，14和21天均未檢測到病毒血癥，只有一頭豬從鼻拭子中檢測到了PRRSV。試驗2的結果則不同。A組在攻毒后3天有1頭出現病毒血癥，攻毒后7天2頭出現病毒血癥；B組僅在攻毒后7天1頭出現病毒血癥；C組攻毒后3天2頭有病毒血癥。D組所有豬在攻毒后至少出現過一次病毒血癥。（陽性豬比例：攻毒后3天，D ＞ A = B = C；P ＜ 0.02）。

母豬PRRS控制的關鍵是使母豬群產生并維持一定的免疫水平。如先前的報道，盡管后備母豬和經產母豬的免疫不能提供完全的保護力，但是可以對流產有一定的改善，感染后能減少病毒血癥或者鼻腔排毒的持續(xù)時間。問題是，如何確保后備母豬和能繁母豬第一次免疫后免疫力可以維持整個生產周期。因而，維持母豬免疫力的有效方案是PRRS控制的關鍵。

先前的研究中觀察到間隔一個月免疫兩次滅活疫苗能夠誘導高水平的再次刺激機體產生IFN-γ的細胞（CMI）。試驗1評估了重復免疫滅活疫苗3次或4次的免疫效果。做兩次滅活疫苗基礎免疫后比較免疫三次和四次滅活苗的免疫效果。

首免和二免間隔3個月是豬場普遍采用的方式。和先前的報道相同，這個研究中，滅活疫苗一次免疫后沒有誘導明顯的體液和細胞免疫。但再次免疫后CMI明顯提高。

不同組的IFN-γ-SC動態(tài)變化和平均值在不同免疫程序中是相似的。這個結果和Piras等（2005）所報道的一致。該研究使用相同的滅活疫苗誘導IFN-γ-SC的產生。IFN-γ-SC位于CD4+CD8αint 和CD4-CD8αhigh之間，可能會誘導活化的輔助T細胞和經典的殺傷性T細胞。

在本研究中，有意思的是IFN-γ-SC在二免后快速上升，但大約一個月后開始下降。PRRSV攻毒誘導IFN-γ-SC顯著上升，這跟記憶細胞的變化模式一致。重復免疫滅活疫苗能夠產生持續(xù)性的基本免疫水平。此外，盡管滅活疫苗在攻毒前很少能有效的誘導體液免疫應答，但是攻毒后免疫滅活疫苗的豬產生了中和抗體，且比未免疫的豬免疫應答快。說明B細胞也和抗原進行了結合。這就可以解釋為什么免疫的母豬在感染后具有快速產生免疫應答的能力。

試驗中令人吃驚的是，疫苗免疫豬未經處理的PBMC組織也會自發(fā)產生高水平的IFN-γ。同樣現象在先前有報道。雖然滅活疫苗的成分可以誘導天然IFN-γ釋放的原因還未闡明，但暗示可能是疫苗佐劑的原因。本研究中未免疫疫苗的對照動物僅接種了疫苗佐劑，且IFN-γ未在不經處理的PBMC中檢測到。說明這不是佐劑的作用。此外，滅活疫苗有誘導PBMC自發(fā)分泌IL-10的能力。我們的研究中，僅僅在最后一次免疫PRRS滅活疫苗后1個月的陽性豬（4/14）中才檢測到自發(fā)產生IL-10的情況。這些結果和Zuckermann等（2007）報道一致。PBMC自發(fā)分泌IL-10在免疫后28天開始下降。我們的研究中，攻毒后IL-10的變化和數量在對照組（C組）疫苗免疫組（A和B組）是相似的。暗示IL-10可能主要與先天性抗感染有關。

先前的研究已經闡述了活疫苗和滅活疫苗的組合使用可能是提高抗PRRSV免疫反應的可選策略。試驗2中，我們評價了在活疫苗首次免疫后，進行一次和兩次滅活疫苗免疫的效果。同時，為了對比活+死組合使用效果，我們也做了兩次免疫活疫苗的設計。和預期的相同，所有首免活疫苗的豬由ELISA檢測為陽性，之后兩種疫苗接種后S/P值均未見明顯升高。

盡管如此，三個疫苗免疫組中，中和抗體陽性的動物數量在再次免疫后均增多了。說明再次免疫僅針對一些病毒抗原，而對ELISA板中包被的抗原沒有特異性。這些結果也和先前報道的一致。特別是Baker等（1999）推斷免疫活疫苗的母豬只有在免疫滅活疫苗時才能激活記憶性免疫。還有一個類似的研究評價了兩種疫苗的組合使用效果，證實活疫苗作為基礎免疫，滅活苗進行二免的效果比其他免疫方案要好（單獨使用滅活苗或者活疫苗；滅活苗做基礎免疫，活疫苗做二免）。原因很難確定，但是我們推斷可能是滅活疫苗的佐劑或者抗原增強混合物的作用。

關于IFN-γ反應，我們還發(fā)現了一個有趣的情況。在試驗2中，A組和C組再次接種滅活苗后1個月，我們可以明顯觀察到免疫記憶反應。雖然B組（活+死）也觀察到了，但是反應強度較低。再次免疫后不同組比較，A組，C組與B組之間有顯著的統(tǒng)計學差異。這樣的差異現象很難弄清楚原因?？赡艿脑蚴且呙缡褂貌煌淖魟?，或者活疫苗具有調節(jié)免疫應答的潛在能力。這個問題需要進一步的研究。

結論

本研究證明重復免疫滅活疫苗可以激發(fā)免疫反應，包括產生中和抗體和CMI，以及攻毒保護效果。此外，與兩次弱毒活疫苗免疫相比，活+死的免疫方案可以產生相似的或者更優(yōu)的中和抗體和CMI水平，以及相似的保護力。下一步研究要確認達到這樣保護水平的最小免疫劑量。

原文題目：Comparison of different vaccination schedules for sustaining the immune response against procine porcine reproductive and respiratory syndrome virus

作者：I. Díaz, M. Gimeno, A. Callén等