摘要：本研究以我國首例非洲豬瘟疫情中分離的流行毒株(SY18)為親本株構(gòu)建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株，針對基因缺失株的安全性和免疫保護效果進行了特性研究。結(jié)果顯示，MGF和CD2v雙基因缺失株對豬安全，接種豬能夠100%抵抗親本毒株SY18株的攻擊，對照豬全部死亡。

來源：中國獸醫(yī)學報

迄今，國際上采用基因工程手段獲得了多個ASFV基因缺失疫苗候選株，以及通過細胞傳代致弱和從自然界分離弱毒株的方法獲得了弱毒疫苗候選株，其中一些疫苗候選株在研究報道中針對同源病毒株攻擊有50%~100%保護率，但對異源病毒的攻擊保護效果不甚理想。此外，無論是人工基因缺失弱毒株還是自然缺失弱毒株，豬免疫后出現(xiàn)劑量依賴性副反應(yīng)，免疫豬出現(xiàn)精神沉郁，食欲降低，發(fā)熱、病毒血癥、高丙球蛋白血癥、肺炎、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、慢性病變和僵豬等，降低了疫苗的實際使用價值。人工基因缺失株盡管具有很好的免疫標記，但基因缺失疫苗的有關(guān)報道不多。目前人們普遍關(guān)心的是非洲豬瘟基因缺失株和自然弱毒株作為疫苗的安全性問題。我國現(xiàn)有國情決定了我國現(xiàn)階段應(yīng)走疫苗免疫防控路線。

ASFV擁有超大基因組，長160~ 190 kb，編碼160多種蛋白，其中50多種為結(jié)構(gòu)蛋白。病毒編碼的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，但目前通過與自然弱毒株基因組序列的比較和分析等方法確認的與免疫抑制有關(guān)的基因只有少數(shù)幾種，包括CD2v、MGF、9GL等。在已經(jīng)報道的自然弱毒株和構(gòu)建的基因缺失株當中，研究較多的是MGF和CD2v基因缺失株。本研究利用國內(nèi)報道的第1起疫情的病毒分離株SY18株首先構(gòu)建了MGF、CD2v單基因缺失和二者的雙基因缺失共3株重組病毒。動物安全性和免疫效果試驗證明，MGF基因單缺失和MGF、CD2v雙基因缺失毒株對免疫豬既具良好的安全性又呈現(xiàn)很好的攻毒保護效果，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報告如下：

首先構(gòu)建同源重組用質(zhì)粒。從ASFV流行株SY18株基因組中擴增獲得CD2v和MGF基因側(cè)翼各1200bp序列作為同源重組質(zhì)粒同源臂。CD2v兩側(cè)翼片段間克隆有綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)基因，MGF兩側(cè)翼片段中克隆紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因表達框。

之后進行重組病毒拯救和純化。將二者的同源重組質(zhì)粒(2μg)分別轉(zhuǎn)染6孔細胞培養(yǎng)板中的豬的原代肺泡巨噬細胞培養(yǎng)物(細胞數(shù)約為106個)，4h后感染SY18株(1 MOI)，48h后挑取熒光細胞(含有重組病毒)，經(jīng)3輪有限稀釋法純化篩選，分別獲得了ASFV SY18△CD2v、ASFV SY18△MGF和ASFV SY18△MGF/△CD2v共3株基因缺失病毒。對拯救的重組病毒進行PCR鑒定和序列分析以及純凈性檢驗，證明我們成功獲得了CD2v和MGF單基因缺失毒株(ASFV SY18△CD2v和ASFV SY18△MGF)及二者雙基因缺失毒株(ASFV SY18△MGF/△CD2v)。病毒的總體構(gòu)建策略如圖1所示。

圖1 ASFV 基因缺失病毒構(gòu)建策略圖

最后開展了重組病毒特性研究。共用35只健康豬，均分為7組，分別接種3株病毒的2種接毒劑量，具體接種方案如表1。

表1 生物安全評價接種方案

記錄7組豬的體溫和臨床表現(xiàn)，并對免疫豬血液、糞、唾液進行ASFV核酸PCR檢測。結(jié)果表明：

1.組1和組2中豬接種ASFV SY18△CD2v毒株后次日起體溫出現(xiàn)升高，高達42°C以上，3~5 d內(nèi)全部死亡。說明CD2v單基因缺失沒有明顯致弱病毒毒力。這和國外文獻報道結(jié)果不一致。

2.組3中豬接種103 TCID50的ASFV SY18△MGF后，次日開始有的豬出現(xiàn)體溫升高，持續(xù)1~3 d，但均未超過41.3C ，隨后恢復(fù)正常，后期未見體溫異常，觀察期精神狀態(tài)正常，采食量未見異常;組4中豬接種104 TCID50的ASFV SY18△MGF后次日有的豬出現(xiàn)體溫升高，體溫范圍在40.2~41.3C之間，持續(xù)8~13日不等，隨后恢復(fù)正常，未見精神沉郁或采食量減少等臨床癥表現(xiàn)。

3.組5、6中豬以103TCID50 和104TCID50劑量接種ASFV SY18△MGF/ △CD2v后，只出現(xiàn)1~2d內(nèi)體溫升高，體溫均在40.5C以下，隨后體溫恢復(fù)正常，采食量和精神狀態(tài)均未見異常。說明，MGF基因缺失可顯著降低ASFV毒力，與國外有關(guān)研究結(jié)果一致;在MGF基因缺失基礎(chǔ)上進一步缺失CD2v基因，可明顯降低單純?nèi)笔GF基因的ASFV所引起的較長時間的發(fā)熱反應(yīng)，安全性進一步提高。對觀察期內(nèi)采集的血液、糞、唾液進行的ASFV核酸檢測結(jié)果表明，在血液、唾液中可偶爾檢測到病毒核酸，糞便中檢測結(jié)果陰性。

對組3、5、6中的5頭豬在免疫后28d，連同組7中5頭攻毒對照豬，以ASFV SY18強毒株進行攻毒試驗，攻毒方式為口服，攻毒劑量為103 TCID50，觀察35日。結(jié)果，組3.5.6中免疫豬均獲得完全保護，在觀察期內(nèi)檢測體溫均在正常范圍內(nèi)，未見任何異常臨床表現(xiàn)。對照組5只豬全部發(fā)病，42℃以上高燒持續(xù)2~7 d后全部死亡。結(jié)果說明，ASFV SY18△MGF/△CD2v不僅具有很好的安全性，而且具有良好的攻毒保護效果，可作為良好的ASF預(yù)防疫苗候選株。

ASF屬于OIE規(guī)定的必須通報的動物傳染病，我國將其歸類為一類傳染病。在目前控制ASF傳染源、切斷傳播途徑、保護易感動物等生物安全措施均不能完全奏效情況下，研發(fā)安全有效的疫苗，保障生豬供應(yīng)是我國生豬養(yǎng)殖刻不容緩亟需解決的問題。盡管疫苗的使用有可能縱容傳染源的存在、放松傳播途徑的切斷，甚至在很大程度上給ASF根除帶來嚴重挑戰(zhàn)，但從保障國內(nèi)生豬供應(yīng)和解決國計民生角度考慮，在可控范圍內(nèi)使用疫苗可能是目前在缺乏有效手段阻止ASF傳播情況下無奈且唯一有效的選擇。

本研究采用基因工程方法構(gòu)建了缺失ASFV 毒力基因的缺失株，對其在動物體內(nèi)的免疫效果和安全性進行了初步評價，顯示免疫MGF單基因和MGF、CD2v雙基因缺失的豬對ASFV強毒攻擊具有完全的保護作用，說明其可作為我國非洲豬瘟疫苗候選株，值得進一步研究和探索。目前全球范圍內(nèi)，很多學者對非洲豬瘟疫苗的研發(fā)持懷疑甚至反對態(tài)度，這主要是因為ASFV不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，在豬體產(chǎn)生免疫保護的情況下，強毒依然可感染并產(chǎn)生病毒血癥。研究證實，ASFV自然弱毒株在試驗豬可造成嚴重的副作用，更有可能出現(xiàn)新的變異和新的流行。因此使用疫苗對于消除非洲豬瘟確實是不利的。進一步提高疫苗候選株的安全性和擴大疫苗效力的評價范圍以及更為長期的生物安全評價對于非洲豬瘟疫苗而言是十分必要的。

已經(jīng)報道的ASFV毒力相關(guān)基因有多種，本研究只選擇了目前國際上報道較多的MGF和CD2v基因作為缺失對象。我們的結(jié)果顯示，CD2v基因單獨缺失對病毒毒力影響有限，而MGF基因(含3個MGF505基因和3個MGF360基因)缺失后，高劑量免疫后盡管會引起較長時間的體溫升高，但是不影響機體的精神狀態(tài)和采食量。在低劑量免疫時，導(dǎo)致機體長時間發(fā)熱的現(xiàn)象消失。在MGF缺失基礎(chǔ)上進一步缺失CD2v基因后，病毒接種引起的長時間發(fā)熱現(xiàn)象基本消除，說明盡管CD2v單基因缺失株毒力很強，但CD2v基因缺失能夠進一步降低MGF缺失株的毒力。

盡管我們構(gòu)建的ASFV雙基因缺失疫苗具有很好的安全性和免疫保護效果，但由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，病毒感染和免疫機制尚未完全明確，且ASFV產(chǎn)生的抗體不具中和活性，因此ASFV SY18△MGF/△CD2v長期使用的安全性及免疫持續(xù)期有待進一步評價。從安全性的角度考慮，研究ASFV亞單位疫苗、病毒載體疫苗等也將是未來非洲豬瘟疫苗研究的重要方向。 來源：中國獸醫(yī)學報